Физиологическая роль оксида азота
в организме
The
Physiological Role Of Nitric Oxide In Organism
Оксид азота (NO) является одним из наиболее важных биологических медиаторов, который вовлечен в множество физиологических и патофизиологических процессов. Он представляет собой уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. В частности, оксид азота участвует в реализации многих важных физиологических функций, таких как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакции иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др., а также некоторых патологических процессов [20,22,24,36]. Важная роль оксида азота в многочисленных биологических процессах в организме явилась основанием для того, чтобы назвать NO в 1991 году Молекулой Года [7,18].
В 1980 г. Furchgott и Zawadzki впервые описали релаксацию кусочков аорты с интактным эндотелием в ответ на ацетилхолин (АХ). Это свидетельствовало о присутствии вещества, выделяемого эндотелиальными клетками и влияющего на миоциты. Вещество было названо эндотелий-зависимым релаксирующим фактором (EDRF) [10]. Было показано, что EDRF посредством активации растворимой гуанилатциклазы (ГЦ) и последующего синтеза вторичного мессенджера циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) вызывает расслабление гладкой мускулатуры сосудов [10]. Позже Palmer et al. [28] идентифицировали EDRF как NO, который продуцируется эндотелиальными клетками.
Биохимия и свойства оксида азота
Термином «оксид азота» (или «окись азота») обозначается восстановленная форма моноокиси азота (NO) с периодом полураспада от 2 до 30 с [20,21]. NO представляет собой растворимый в воде и жирах бесцветный газ с уникальными физиологическими свойствами. В химическом отношении NO представляет собой маленькую липофильную молекулу, состоящую из одного атома азота и одного атома кислорода и имеющую непарный электрон, что превращает ее в высоко реактивный радикал, свободно проникающий через биологические мембраны и легко вступающий в реакции с другими соединениями [20,21].
В организме NO синтезируется клетками из аминокислоты L-аргинин [25,39]. Этот процесс представляет собой комплексную окислительную реакцию, катализируемую ферментом NO-синтазой (NOS), которая присоединяет молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина (рис.1).
В настоящее время идентифицированы три изоформы NOS, которые названы согласно с тем типом клеток, где они были впервые обнаружены [8]: NOS-1 - нейрональная (nNOS) или мозговая (bNOS); NOS-2 - индуцибельная (iNOS) или макрофагальная (mNOS); NOS-3 - эндотелиальная (eNOS). Изоформы NOS являются продуктами различных генов. Ген первой из них расположен в 7-й, второй - в 12-й и третий - в 17-й хромосомах [1].
Хотя все изоформы NOS катализируют образование NO, каждая из них имеет свои особенности как в механизмах действия и локализации, так и в биологическом значении для организма. Поэтому указанные изоформы принято также подразделять на конститутивную (cNOS) и индуцибельную (iNOS) синтезы оксида азота.
Конститутивная NOS (cNOS), которая включает две изоформы (NOS-1 и NOS-3), постоянно находится в цитоплазме (то есть является ингредиентной), зависит от концентрации кальция и кальмодулина, а также способствует выделению небольшого количества NO на короткий период в ответ на рецепторную и физическую стимуляцию. Фермент существенно инактивируется при низких концентрациях свободного кальция и максимально активен при его содержании около 1 мМ. NO, образующийся под влиянием cNOS, действует как переносчик в ряде физиологических ответов [8,26,39].
Что касается особенностей локализации, то nNOS, как было установлено, в большом количестве присутствует в нейронах, эндотелиальных клетках, в том числе эндотелии эфферентной артериолы почек, в тромбоцитах, macula densa, в незначительном количестве в толстой восходящей части петли Генле и других тубулярных сегментах и, возможно, в нисходящей vasa recta, а также в мозговом слое надпочечников, скелетных мышцах и др. [3,16]. eNOS локализуется в больших количествах в эндотелии и, в частности, в тромбоцитах, интерлобулярной и афферентной артериолах, эфферентной артериоле, возможно, в нисходящей vasa recta, а также в гломерулах, мезангиальных клетках и др. [3, 8].
Хотя eNOS является мембранно-связанной, а nNOS - цитозольной, механизм их действия сходен и состоит в следующем. Ca2+ под влиянием определенных стимулов (ацетилхолин, гистамин, 5-оксиптриптамин, глутамат и др.) входит в клетку, где связывается в единый комплекс с кальмодулином в цитозоле. Комплекс Ca-кальмодулин выступает как кофактор и активирует NOS. Под влиянием ингредиентной NOS образуются очень малые количества NO, которые измеряются пикомолями [35], но, продуцируемый под влиянием этих изоформ NOS, осуществляет, главным образом, местную регуляцию, действуя в стандартных условиях. NO активирует клеточный фермент гуанилатциклаза (ГЦ), что приводит к образованию циклического гуанозина моно фосфата (цГМФ), который и опосредует все эффекты NO. Будучи липофильной молекулой, NO легко диффундирует через клеточные мембраны и проникает в соседние клетки (например, из эндотелиальных в миоциты сосудов), где образующийся цГМФ снижает уровень свободного Ca и активирует киназу легкой цепи миозина, вызывая дилатацию сосуда.
NO может также активировать натрий-калиевый насос наружной клеточной мембраны, что приводит к ее гиперполяризации. Именно этот механизм приводит к дилатации сосуда при увеличении тока крови и напряжения (например, пульсового) сосудистой стенки.
NO, продуцируемый под влиянием nNOS и eNOS, при некоторых формах патологии, наряду с регуляторным, оказывает и протективное (защитное) действие.
Индуцибельная NOS, которая представлена NOS-2, появляется в клетках только после индукции их бактериальными эндотоксинами и некоторыми медиаторами воспаления. В частности, этот процесс может провоцироваться бактериальными липополисахаридами, некоторыми эндотоксинами и цитокинами, такими как интерлейкин-1, интерлейкин-2, g-интерферон, фактор некроза опухоли и др. [4,13,27].
В клетках, находящихся в покое, iNOS обычно не определяется, но после индукции появляется в макрофагах, нейтрофилах, мезангии, клетках эпителия канальцев почки, эндотелии афферентной артериолы и других почечных сосудов, в клетках капсулы клубочка, мышечных клетках сосудистой стенки, сердца, матки, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, в купферовских клетках, гепатоцитах, клетках макро- и микроглии и др. Функциональная активность ее не зависит от поступления ионов Са2+ в клетку, поэтому она называется кальций-независимой, а активация сопровождается повышением генной транскрипции [4,8,13,27].
Количество NO, образующегося под влиянием iNOS, может варьировать и достигать больших цифр (наномолей). При этом продукция NO сохраняется длительнее. Именно iNOS и образующийся под ее влиянием NO играют главную роль в подавлении активности бактериальных и опухолевых клеток путем блокирования некоторых их ферментов, в развитии артериальной гипертензии, нарушении процессов перекисного окисления липидов, в развитии и поддержании других патологических процессов, особенно в почке [14].
В синтез NO посредством NOS включаются, по крайней мере, шесть важнейших кофакторов: никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ-Н), флавинадениндинуклеотид (ФАД), флавинмононуклеотид (ФМН), тетрагидробиоптерин, гем- и кальмодулин. NO может вступать в реакцию с гемической группой гемоглобина, как и с другими гемсодержащими протеинами и ферментами, образуя при этом метгемоглобин, который можно рассматривать как транспортную форму оксида азота [15,26].
Биологическая активность NO стимулируется некоторыми агонистами, включая L-аргинин, АХ, брадикинин и др. [14]. Но синтез NO является регулируемым процессом и может тормозиться различными аналогами L-аргинина, которые являются конкурентными ингибиторами NOS. При этом N-омега-циклопорил-L-аргинин является селективным ингибитором cNOS, в то время как аминогуанидин - iNOS [2]. Некоторые другие аналоги L-аргинина, такие как N-монометил-L-аргинин (L-NMMA), N-нитро-L-аргининметиловый эфир (L-NAME), N-нитро-L-аргинин (L-NNA) способны тормозить выработку NO обоими ферментами [33]. Выработка NO может также замедляться или прекращаться под влиянием гемопротеинов, метиленового голубого, супероксид радикалов, этанола, глюкокортикостероидов, индометацина [2].
Особое значение в рассмотрении физиологической роли NO имеет вопрос регуляции активности NO-синтазы. Конститутивные (ингредиентные) формы NOS (eNOS и nNOS) регулируются уровнем внутриклеточного Ca. Внеклеточные гормоны и другие агенты, взаимодействуя с поверхностными клеточными рецепторами, открывают кальциевые каналы, и Ca проникает внутрь, где в комплексе с кальмодулином активирует NOS. Связанный с NOS кальмодулин способствует передаче электрона с НАДФ-Н на флавопротеиновый домен NOS и далее с флавина на гемовый домен NOS. Этот электрон необходим для активации железа гемового домена, после чего железо связывает кислород, который реагирует с L-аргинином с образованием NO и цитруллина. Очевидно, что наличие всех перечисленных компонентов, также как и их недостаточность, важны для регуляции синтеза NO конститутивными формами NOS.
Клиренс NO происходит путем образования нитритов и нитратов, а цГМФ метаболизируется до гуанозина (рис. 1). В клиренс NO могут быть вовлечены промежуточные ступени, связанные с гемоглобином или со взаимодействием супероксида с образованием пероксинитрита.
Биологическое действие и физиологическая роль оксида азота
Характерной особенностью NO является его способность быстро диффундировать через мембрану синтезировавшей его клетки в межклеточное пространство и также легко (не нуждаясь в рецепторах) проникать в клетки-мишени. Внутри клетки он активирует одни энзимы и ингибирует другие. Одной из важных мишеней NO является внутриклеточная растворимая ГЦ [20,21]. Активация этого энзима сопровождается образованием цГМФ, под влиянием которого происходит релаксация гладкомышечных волокон сосудистой стенки (рис. 2). Этому способствует прямая активация К+ каналов [30]. Базальный тонус сосудов определяется выраженностью тонического напряжения расположенных в их стенке гладкомышечных волокон. Активный вазоконстрикторный тонус этих мышц определяется влиянием адренергической системы, главное ядро которой расположено в ромбовидной ямке [5]. Кроме вазоконстрикторного тонуса, сосуды обладают способностью к активной вазодилатации, которая обусловлена секрецией NO его синтазой, расположенной в клетках сосудистого эндотелия [20,21].
Обобщая результаты проведенных ранее исследований, можно сказать, что в каждый момент времени тонус сосудов, а следовательно и уровень артериального давления, определяется балансом вазоконстрикторных и вазодилататорных влияний на гладкомышечные волокна сосудистой стенки [5,23,36].
Необходимо обратить внимание, что для действия таких вазодилататоров как ацетилхолин, гистамин, брадикинин, серотонин, адениновые нуклеотиды и некоторых других факторов необходимым условием является сохранение целостности эндотелия сосудов. Поэтому они получили название «эндотелий-зависимые вазодилататоры». Стимуляция эндотелия этой группой веществ приводит к выработке NO, который, диффундируя к гладкомышечным клеткам, вызывает расширение сосуда через образование цГМФ (рис. 2) [30]. Такой процесс имеет место в физиологических условиях, когда выделяемые локально небольшие количества NO быстро инактивируются оксидной реакцией, переходя в нитрит (NO2-) или нитрат (NO3-), каждый из которых не является вазодилататором.
NO по сути является локальным тканевым гормоном, поддерживающим активную вазодилатацию, и одним из основных факторов, регулирующих кровоток и контролирующих базальное артериальное давление [6,38].
В сердце NO, выделяемый эндотелиальными клетками, через повышение внутриклеточной концентрации цГМФ обеспечивает контрактильную функцию миокарда, усиливая релаксацию желудочков и увеличивая диастолическую растяжимость [29]. Показано также, что NO, который образуется внутри кардиомиоцитов, является чрезвычайно важным в осуществлении b-адренергическогоинотропного и хронотропного ответов [30].
Давно известно, что эндотелиальные клетки влияют на процессы коагуляции и тромбоза, но только недавно выяснилось, что этот процесс зависит от NO. Установлено, что эндотелиальные клетки посредством секреции NO повышают внутриклеточный уровень цГМФ в тромбоцитах, что способствует ингибиции их адгезии и агрегации [31]. Причем этот процесс осуществляется по принципу отрицательной обратной связи, поскольку тромбоциты также обладают способностью к синтезу NO и могут активировать агрегацию.
NO также обладает способностью ингибировать адгезию лейкоцитов к стенке сосудов и влиять на выработку факторов роста, а также оказывает антимитогенное и антипролиферативное действие [14,30].
Еще один очень важный аспект физиологической роли NO связан с его биологическими свойствами в качестве нейротрансмиттера, что обусловлено длительностью жизни NO и способностью диффундировать от места синтеза на 100 мкм [32]. NO широко представлен как в центральной, так и в периферической нервной системе. Он выделяется в постсинаптических нейронах под влиянием нейротрансмиттеров, из которых наиболее изучен глутамат [41]. Известно, что глутамат, синтезируемый пресинаптическими нейронами, стимулирует N-метил-D-аспартат-рецепторы (NMDA-рецепторы) постсинаптических нейронов, активация которых способствует повышению внутриклеточной концентрации Ca2+ и в последующем - усилению активности nNOS, что в конечном итоге приводит к повышению синтеза NO [41]. NO специфически не связывается с рецепторами постсинаптической мембраны, как в случаях с классическими нейротрансмиттерами, но он диффундирует в другие участки, включая пресинаптические нейроны (то есть действует как ретроградный мессенджер) и другие смежные нейроны и глиальные клетки (рис. 3). Полагают, что NO действует, вероятно, как нейромодулятор, скорее опосредуя динамическую активность нейронов, а не оказывая прямое влияние на активность их потенциалов [11].
Вместе с тем установлено, что NO может выступать в роли нейротрансмиттера, опосредуя эффекты так называемых неадренергических-нехолинергических нейронов (NANC-нейроны), которые, наряду с холин- и норадренергическими проводниками автономной нервной системы, могут представлять третий тип нервной системы [32]. Этот тип нейронов называют еще нитринергическими, и они описаны в сердце, пищеварительной системе и в дыхательных путях, где они иннервируют как сосудистую, так и внесосудистую гладкую мускулатуру [32]. Стимуляция NANC-нейронов приводит к биосинтезу и выделению ими NO, который посредством цГМФ вызывает, например, бронходилатацию [2], глубокую релаксацию артериальных сосудов, адаптивную релаксацию желудка, гладких мышц нижней части пищевода и гладких мышц двенадцатиперстной кишки, а также циркулярной мышцы тонкой кишки, что обеспечивает перистальтику и передвижение пищевых масс вдоль кишечника [12,17].
NO играет важную роль в регуляции функций легких и в патофизиологии заболеваний системы дыхания. В легких NO производится под влиянием cNOS в эндотелиальных клетках легочной артерии и вены, в ингибиторных неадренергических-нехолинергических нейронах. В ряде клеток, имеющихся в легких и способных вырабатывать NO, включая макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эндотелиальные, гладкомышечные клетки, эпителиальные клетки и, возможно, клетки других типов, представлена экспрессия iNOS. Более поздние исследования показали, что в дыхательных путях cNOS характеризуется высокой гомологичностью к iNOS и присутствует в эпителиальных клетках [2].
Помимо синтеза NO в эндотелии легочных сосудов, NOS представлена в эпителии воздухоносных путей. Человеческий трахеальный, бронхиальный и бронхоальвеолярный эпителий НАДФ-Н-диафораза-реактивен, что является идентичным cNOS. Изучено состояние НАДФ-Н-диафоразы человеческого плода в первой и второй половине беременности. Выяснено, что у плода в первой половине беременности снижена активность фермента в направлении от более крупных (11-го порядка) к более мелким (16-го порядка) бронхиолам, что соответствует направлению формирования легких в онтогенезе. У плода во второй половине беременности градиент активности фермента возрастает от бронхиол 11-го порядка к бронхиолам 16-го порядка. Видимо, у плода в возрасте 35-37 нед. повышение активности cNOS в претерминальных бронхиолах, отвечающих за наполняемость воздухом респираторных отделов легкого, связано с подготовкой легких к функционированию [2].
У здоровых детей и взрослых в образовании эндогенного NO преимущественно участвуют верхние дыхательные пути. При этом в полости носа образуется более 90% NO и 50-70% образовавшегося NO аутоингалируется и попадает в легкие. Нижние дыхательные пути также участвуют в образовании NO, но в воздухе из нижних дыхательных путей количество газа значительно меньше, чем в воздухе, находящемся в полости носа и рта [2]. Полагают, что вырабатываемый конститутивно верхними отделами дыхательных путей NO необходим для поддержания воздухопроводимости этого отдела легких.
Установлено, что нарушение продукции и/или разрушение NO имеет значение при возникновении гиперреактивности дыхательных путей в патофизиологии бронхиальной астмы. Огромный интерес к NO связан также с возможностью использования его в качестве терапевтического агента. Во многих случаях ингаляции NO устраняют легочную вазоконстрикцию, связанную с гипоксией, первичной легочной гипертонией, сердечными пороками, персистирующей гипертонией новорожденных и респираторным дистресс-синдромом. В отличие от других известных вазодилататоров, которые могут вызывать системную гипотонию, ингаляции NO не дают системного эффекта и улучшают артериальную оксигенацию. Ингаляции экзогенного NO могут рассматриваться в качестве альтернативной терапии бронхоспазма [2].
Влияние NO на систему пищеварения изучено менее подробно. Иммуногистохимическими методами установлено содержание NOS в нейронах сплетения Ауэрбаха [17]. Их электрическая стимуляция сопровождается секрецией NO и релаксацией кишечника, что может быть предотвращено назначением ингибиторов NOS. Нейроны, содержащие NOS, обнаружены также в адвентиции сосудов желудочно-кишечного тракта. Это свидетельствует о том, что NO является нейротрансмиттером также в периферических нервах желудочно-кишечного тракта [17].
Среди физиологических функций NO в отношении пищеварительной системы наиболее важной является обеспечение моторной функции желудочно-кишечного тракта, а также регуляции поступления желчи в кишечник [1,17]. Кроме того, NO следует отнести к числу наиболее важных факторов защиты слизистой желудка. Его влияние осуществляется путем воздействия на кровоснабжение слизистой. Блокада NOS резко уменьшает кровоток в сосудах слизистой. Косвенно это сказывается на секреторной функции желудка, на способности его слизистой противостоять воздействию на нее факторов агрессии, на возникновении и заживлении эрозий и язв [1].
Как уже было отмечено, в различных отделах почки представлены все три изоформы NOS и продуцируемый с их участием NO играет одну из ключевых ролей ее физиологии [3,9,35]. Как было недавно установлено, NO является важным регулятором почечной гемодинамики и гломерулярной фильтрации [34], ингибирует транспорт натрия и увеличивает его экскрецию [37]. Более подробно роль NO в физиологии и патофизиологии почки в возрастном аспекте будет освещена в специальном обзоре.
Продуцируемый в результате активации iNOS NO прежде всего предназначен для защиты организма хозяина, он способствует снижению активности пограничных воспалительных клеток, гибели микроорганизмов и внутриклеточных паразитов, тормозя агрегацию тромбоцитов и улучшая местное кровообращение. В то же время, в очаге воспаления накапливается продукт частичного восстановления кислорода - супероксид, количество которого при патологических ситуациях достигает 0,01-0,1 мМ. NO и супероксид-анион подвергаются быстрому радикал-радикальному взаимодействию с образованием медиатора окислительного клеточного повреждения-пероксинитрита. Пероксинитрит вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, повреждает сосудистый эндотелий, увеличивает агрегацию тромбоцитов, участвует в процессах эндотоксемии, остром легочном повреждении при респираторном дистресс-синдроме [2]. При этом NO легко проходит через внешнюю и внутреннюю мембраны клеток и, оказавшись внутри клетки, он повреждает ДНК клетки-мишени путем ее дезаминирования [40], а также ингибиции рибонуклеотидредуктазы [19], которая регулирует скорость репликации ДНК. Кроме того, NO инактивирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, блокируя этим гликолитический синтез АТФ, и ингибирует электронный транспорт в митохондриях [20]. Это и объясняет ее цитотоксическое действие на клетку-мишень. Следовательно, NO, избыточно накапливаясь в клетке, может вызывать повреждение ДНК и давать провоспалительный эффект при эндотоксемии, септическом шоке, воспалительных заболеваниях легких [2].
Таким образом, NO, продуцируемый различными изоформами NOS, оказывает чрезвычайно важное действие на многочисленные физиологические процессы в организме. При этом действие iNOS проявляется в основном при патологических ситуациях, поэтому особенности функционирования и механизмы регуляции этой изоформы, а также продуцируемого ею NO зависят от характера патологического процесса и пораженного органа. Очевидно, что дальнейшее изучение роли NO в норме и при патологии приведет к углублению знаний о патогенезе болезней, а отсюда - к появлению новых методов их терапии.